受阻、非标准氨基酸的微波辅助多肽固相合成

摘要

• 微波增强的多肽固相合成（SPPS）能够快速有效地进行大体积氨基酸（如Aib和N-Me-A）的常规困难偶联。

• 酰基载体蛋白衍生物VQAibAibIDYINGOH和VQ(N-Me-A) (N-Me-A)IDYING-OH 的合成在 2 小时内完成，纯度分别为95% 和 86%。

• GEQKLGAibAibAibASEESLG-NH2 的合成在 3小时内完成，纯度为89%。

介绍

在许多生物学相关的化合物中都可以找到受阻的非标准氨基酸，例如α-氨基异丁酸(Aib)和N-甲基丙氨酸((N-Me)-A)（图1）。^1-3然而，包括Aib或N-甲基化氨基酸已被证明具有挑战性；第二个甲基引入的空间位阻，无论是在α-碳还是酰胺氮上，都使得在常规SPPS中偶联这些氨基酸衍生物变得困难。

图1：位阻、非标准氨基酸

然而，通过使用微波增强的SPPS，与受阻非标准氨基酸相关的困难已被小化。在SPPS中使用微波能量可以快速有效地完成大体积氨基酸（如Aib和N-甲基丙氨酸）的常规困难偶联^4,5。

材料和方法

试剂

N-α-Fmoc-α-氨基异丁酸获自AnaSpec (Freemont, CA)。Fmoc-N- Me-Ala-OH获自Peptides International (Louisville, KY)。所有其他氨基酸均获自CEM Corporation (Matthews, NC)，并含有以下侧链保护基团：Asn(Trt)、Asp(OMpe)、Gln(Trt)、Glu(OtBu)、Lys(Boc)、Ser( OtBu)和Tyr(tBu)。Oxyma Pure和Rink Amide ProTideTM LL树脂购自CEM Corporation (Matthews, NC)。N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)获自CreoSalus (Louisville, KY)。Fmoc-Gly-Wang Resin LL购自NovaBiochem (St. Louis, MO)。哌啶获自Alfa Aesar (Ward Hill, MA)。三氟乙saun(TFA)、3,6-dioxa-1,8-octanedithiol (DODT)、三异丙基硅烷(TIS)和乙酸购自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和无水乙mi(Et2O)购自VWR (West Chester, PA)。HPLC级水(H2O)和HPLC级乙腈(MeCN)购自Fisher Scientific (Waltham, MA)。

多肽合成：GEQKLGAibAibAibASEESLG-NH2

使用CEMLibertyBlue™自动微波肽合成仪在RinkAmideProTide LL树脂（离子交换容量：0.18meq/g）上以0.1mmol规模制备多肽。用哌啶和OxymaPure在DMF中进行脱保护。使用DMF中的DIC、DMF中的OxymaPure和5倍过量的Fmoc-AA-OH进行偶联反应。使用具有TFA/H2O/TIS/DODT的CEM Razor高通量肽切割系统进行切割。裂解后，肽在无水乙mi中沉淀并冻干过夜。

多肽合成：VQAibAibIDYING-OH

使用CEMLibertyBlue自动微波肽合成仪在FmocGly-WangLL树脂（离子交换容量：0.33meq/g）上以0.1mmol规模制备肽。用哌啶和OxymaPure在DMF中进行脱保护。使用DMF中的DIC、DMF中的OxymaPure和5倍过量的Fmoc-AA-OH进行偶联反应。使用具有TFA/H2O/TIS/DODT的CEMRazor高通量肽切割系统进行切割。裂解后，肽在无水乙mi中沉淀并冻干过夜。

多肽合成：VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH

使用CEMLibertyBlue自动微波肽合成仪在FmocGly-WangLL树脂（离子交换容量：0.19meq/g）上以0.1mmol规模制备肽。用哌啶和OxymaPure在DMF中进行脱保护。使用DMF中的DIC、DMF中的OxymaPure和5倍过量的Fmoc-AA-OH进行偶联反应。使用具有TFA/H₂O/TIS/DODT的CEMRazor高通量肽切割系统进行切割。裂解后，肽在无水乙mi中沉淀并冻干过夜。

多肽分析

在配备有PDA检测器的WatersAcquityUPLC系统上分析肽，该检测器配备AcquityUPLCBEHC8柱（1.7mm和2.1x100mm）。UPLC系统连接到Waters3100SingleQuadMS用于结构测定。在WatersMassLynx软件上进行峰分析。使用(i)H₂O和(ii)MeCN中的0.1%TFA梯度洗脱进行分离。

结果

在LibertyBlue自动微波肽合成仪上GEQKLGAibAibAibAibASEEDLG-NH2的微波增强SPPS产生了89%纯度的目标肽（图2）。

图2：GEQKLGAibAibAibASEEDLG-NH2的HPLC色谱图

在Liberty Blue自动微波肽合成仪上的VQAibAibIDYING-OH的微波增强SPPS产生了纯度为95%的目标肽（图3）。

图3：VQAibAibIDYING-OH的HPLC色谱图

在Liberty Blue自动微波肽合成仪上的VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH的微波增强SPPS产生了纯度为86%的目标肽（图4）。

图4：VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH的HPLC色谱图

结论

微波增强的SPPS能够快速有效的进行大体积氨基酸（如Aib和N-Me-A）的常规困难偶联。常规合成GEQKLGAibAibAibASEEDLG-NH2需要40小时且纯度< 10%，但微波增强SPPS在3小时内产生目标肽且纯度为89%。此外，酰基载体蛋白衍生物VQAibAibIDYING-OH和VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH的合成在2小时内完成，纯度分别为95%和86%。微波增强的SPPS已被证明是一种有效的工具，可以大限度地减少SPPS中受阻的非标准氨基酸相关的困难。

参考文献

[1] Mueller, P.; Rudin, D. O.Nature.1968,217, 713–719.

[2] Rebuffat, S.; Goulard, C.; Hlimi, S.; Bodo, B.J. Pept. Sci.2000,6, 519–533.

[3] Ahmed, G.;Elger,W.;Meece,F.;Nair,H. B.; Schneider, B.; Wyrwa, R.; Nickisch, K.Bioorg. Med. Chem.2017,25, 5569–5575. Collins,J.M.Microwave-EnhancedSynthesisofPeptides,Proteins,andPeptidomimetics.InMicrowavesinOrganicSynthesis,Third Edition; de la Hoz, A.;Loupy,A.; Wiley-VCH: Weinheim, 2012;897–959.

[4] Ben Haj Salah, K.; Inguimbert, N.Org. Lett.2014,16(6), 1783–1785.